国家动物模型信息平台收录EV71感染PSGL1转基因小鼠模型

　　手足口病是肠道病毒引起的传染性、出疹性疾病，该病多发生于5岁以下的婴幼儿，可引起发热和手、足、口腔等部位的皮疹、溃疡，个别手足口病患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症，而神经源性肺水肿、肺出血和心力衰竭被认为是导致死亡的主要原因。

　　引发手足口病的肠道病毒有20多种，包括柯萨奇病毒A组和B组、人肠道病毒71型（human enterovirus 71，EV71）以及疱疹病毒、腺病毒等，其中以柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus A16，CA16)和肠道病毒71型（EV71）最为常见。而绝大多数重症手足口病病例，均由EV71或CA16病毒感染所致。

　　EV71属于微小RNA病毒科，肠道病毒属，主要通过粪口传播，病毒最初定植于鼻咽部或胃肠道粘膜，侵入淋巴组织并在其中繁殖，进而引起第一次病毒血症。若机体免疫力差，病毒可扩散至全身组织器官，大量繁殖后再次入血，引起第二次病毒血症，最终侵犯靶器官，如脑、脑膜、脊髓、心肌和横纹肌以及皮肤黏膜组织，引起重症病变，其主要病变为神经元坏死等。

　　PSGL-1（P-selectin glycoprotein ligand-1）蛋白是一种糖蛋白，作为细胞粘附分子P-、E-、L-选择素的高亲和力反受体，参与了炎症反应过程中免疫细胞的迁移。同时，有研究表明PSGL-1也是人EV71病毒的受体，在体外细胞实验中表达人PSGL-1蛋白可以提高细胞对EV71的敏感性。由于目前的EV71小鼠模型采用乳鼠（14日龄以内），可用于感染研究的周期太短，且其免疫系统发育不成熟，限制了该模型在研究EV71致病机理中的应用。

　　刘江宁教授课题组通过建立表达人PSGL-1的转基因小鼠，以提高小鼠对EV71病毒的敏感性，从而有望提高敏感小鼠的年龄，建立成年的EV71感染模型。

　　课题组以人PSGL-1的mRNA为模板，经反转录获得人PSGL-1的cDNA，将其插入pCDNA3.1(+)载体的启动子下游，构建转基因载体。载体经测序验证正确后，将其线性化并经显微注射到C57BL/6J的受精卵中，用129做假孕受体，制备转基因小鼠。人PSGl-1转基因小鼠经RT-PCR和Western blotting鉴定，表明人PSGL-1蛋白主要在小鼠的骨骼肌和脑中表达，可检测到该基因的mRNA表达及蛋白（图1）。

　　对10日龄人PSGl-1转基因小鼠腹腔注射感染EV71 病毒的小鼠适应株MP10（GenBank：HQ712020）5×10⁶ TCID₅₀。动物自感染后第3天开始出现症状，表现为体重增长变缓、弓背竖毛、后肢行动迟缓至瘫痪、死亡等症状。感染后第4天时，动物全部表现出后肢瘫痪、停止进食等症状，感染后第5天动物开始出现死亡，在10天内全部死亡，该特征类似于EV71重症感染小鼠模型。实时荧光定量PCR检测表明病毒主要复制部位为骨骼肌和脑，病毒在感染后第3天达到高峰，主要病理表现为坏死性肌炎。

　　相对于野生型小鼠，感染后第3天，PSGL-1转基因小鼠的骨骼肌、脊髓和脑内的病毒载量显著高于野生型小鼠（图2A-C），但是在第5天时，该差别不再明显，表明表达人PSGL-1蛋白可以一过性的促进EV71小鼠适应株感染小鼠。与病毒复制相一致，第3天转基因小鼠的后肢出现双侧瘫痪，症状明显比野生型小鼠严重，但在第5天时症状类似（图2D-E）。提高病毒的感染剂量，并不能使两周以上的转基因小鼠表现出明显的症状，表明人PSGL-1具有一定的促进EV71感染效果。

图1. 人PSGL-1转基因小鼠鉴定.A，人PSGL-1基因设计；B，转基因小鼠基因型鉴定；C，骨骼肌和脑内人PSGL-1基因的mRNA检测；D，Western blotting检测骨骼肌和脑内人PSGL-1蛋白表达检测。

图2. EV71的小鼠适应株MP10感染转基因小鼠和野生型小鼠. A-C，组织内病毒载量，A（骨骼肌），B（脊髓），C（脑）；D，临床症状评分的变化曲线；E，感染第3天和第5天时的小鼠状态照片。

　　该模型信息已提交到国家动物模型资源共享信息平台（简称信息平台），信息平台致力于实验动物资源与疾病动物模型信息的收集和共享，希望通过我们的努力，通过信息的集成与共享，更好的服务于国家重大科技攻关，助力于生物医药产业的发展。

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参考文献：
Jiangning Liu, Wei Dong, Xiongzhi Quan, Chunmei Ma, Chuan Qin, Lianfeng Zhang. Transgenic expression of human P-selectin glycoprotein ligand-1 is not sufficient for enterovirus 71 infection in mice. Arch Virol (2012) 157: 539-543.