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国家动物模型信息平台收录EV71感染PSGL1转基因小鼠模型

2021年07月27日 来源:

  手足口病是肠道病毒引起的传染性、出疹性疾病,该病多发生于5岁以下的婴幼儿,可引起发热和手、足、口腔等部位的皮疹、溃疡,个别手足口病患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症,而神经源性肺水肿、肺出血和心力衰竭被认为是导致死亡的主要原因。

  引发手足口病的肠道病毒有20多种,包括柯萨奇病毒A组和B组、人肠道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)以及疱疹病毒、腺病毒等,其中以柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus A16,CA16)和肠道病毒71型(EV71)最为常见。而绝大多数重症手足口病病例,均由EV71或CA16病毒感染所致。

  EV71属于微小RNA病毒科,肠道病毒属,主要通过粪口传播,病毒最初定植于鼻咽部或胃肠道粘膜,侵入淋巴组织并在其中繁殖,进而引起第一次病毒血症。若机体免疫力差,病毒可扩散至全身组织器官,大量繁殖后再次入血,引起第二次病毒血症,最终侵犯靶器官,如脑、脑膜、脊髓、心肌和横纹肌以及皮肤黏膜组织,引起重症病变,其主要病变为神经元坏死等。

  PSGL-1(P-selectin glycoprotein ligand-1)蛋白是一种糖蛋白,作为细胞粘附分子P-、E-、L-选择素的高亲和力反受体,参与了炎症反应过程中免疫细胞的迁移。同时,有研究表明PSGL-1也是人EV71病毒的受体,在体外细胞实验中表达人PSGL-1蛋白可以提高细胞对EV71的敏感性。由于目前的EV71小鼠模型采用乳鼠(14日龄以内),可用于感染研究的周期太短,且其免疫系统发育不成熟,限制了该模型在研究EV71致病机理中的应用。

  刘江宁教授课题组通过建立表达人PSGL-1的转基因小鼠,以提高小鼠对EV71病毒的敏感性,从而有望提高敏感小鼠的年龄,建立成年的EV71感染模型。

  课题组以人PSGL-1的mRNA为模板,经反转录获得人PSGL-1的cDNA,将其插入pCDNA3.1(+)载体的启动子下游,构建转基因载体。载体经测序验证正确后,将其线性化并经显微注射到C57BL/6J的受精卵中,用129做假孕受体,制备转基因小鼠。人PSGl-1转基因小鼠经RT-PCR和Western blotting鉴定,表明人PSGL-1蛋白主要在小鼠的骨骼肌和脑中表达,可检测到该基因的mRNA表达及蛋白(图1)。

  对10日龄人PSGl-1转基因小鼠腹腔注射感染EV71 病毒的小鼠适应株MP10(GenBank:HQ712020)5×106 TCID50。动物自感染后第3天开始出现症状,表现为体重增长变缓、弓背竖毛、后肢行动迟缓至瘫痪、死亡等症状。感染后第4天时,动物全部表现出后肢瘫痪、停止进食等症状,感染后第5天动物开始出现死亡,在10天内全部死亡,该特征类似于EV71重症感染小鼠模型。实时荧光定量PCR检测表明病毒主要复制部位为骨骼肌和脑,病毒在感染后第3天达到高峰,主要病理表现为坏死性肌炎。

  相对于野生型小鼠,感染后第3天,PSGL-1转基因小鼠的骨骼肌、脊髓和脑内的病毒载量显著高于野生型小鼠(图2A-C),但是在第5天时,该差别不再明显,表明表达人PSGL-1蛋白可以一过性的促进EV71小鼠适应株感染小鼠。与病毒复制相一致,第3天转基因小鼠的后肢出现双侧瘫痪,症状明显比野生型小鼠严重,但在第5天时症状类似(图2D-E)。提高病毒的感染剂量,并不能使两周以上的转基因小鼠表现出明显的症状,表明人PSGL-1具有一定的促进EV71感染效果。

 

图1. 人PSGL-1转基因小鼠鉴定.A,人PSGL-1基因设计;B,转基因小鼠基因型鉴定;C,骨骼肌和脑内人PSGL-1基因的mRNA检测;D,Western blotting检测骨骼肌和脑内人PSGL-1蛋白表达检测。

 

图2. EV71的小鼠适应株MP10感染转基因小鼠和野生型小鼠. A-C,组织内病毒载量,A(骨骼肌),B(脊髓),C(脑);D,临床症状评分的变化曲线;E,感染第3天和第5天时的小鼠状态照片。

 

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参考文献:
Jiangning Liu, Wei Dong, Xiongzhi Quan, Chunmei Ma, Chuan Qin, Lianfeng Zhang. Transgenic expression of human P-selectin glycoprotein ligand-1 is not sufficient for enterovirus 71 infection in mice. Arch Virol (2012) 157: 539-543.

 

 
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